凝膠阻滯實驗的操作方法介紹

　　一、凝膠阻滯實驗定義

　　凝膠阻滯實驗（gelreiardadonassay，又稱為mobthtyshiftassay）方法簡單、靈敏，可以定量的特性使它在研究轉(zhuǎn)錄和基因調(diào)控中廣泛的應用。目前通常用于RNA(或DNA)結(jié)合蛋白的純化，確定一種已知或可能的RNA結(jié)合蛋白所識別的序列，建立反應常數(shù)（如親和常數(shù)和解離常數(shù)）等。

　　二、操作方法

　　1.RNA和蛋白的結(jié)合反應

　　(1)冰浴，微量離心管中加入下列試劑，并混勻：末端標記的RNA片段1ng，10X結(jié)合緩沖液2μl，末標記的同種RNA適量，待測蛋白適量，加水至20μl。

　　(2)37°C溫育反應液30min，溫度和時間需要通過經(jīng)驗確定，對于大多數(shù)反應，30min足夠達到平衡。

　　2.非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳

　　(1)凝膠可以提前制備。用水和乙醇*淸洗玻璃板，使用0.7mm薄墊片，12齒梳子，每齒的尺寸為0.8cmX1.5cm，玻璃板的尺寸為18cmX23cm。

　　(2)混合適當?shù)膬Υ嬉旱玫?0ml的溶液，含有6%丙烯酰胺、0.12%甲叉雙丙烯酰胺、25mmol/LTris堿，0.2mol/L甘氨酸、5%甘油，加入15mg過硫酸銨和TEMED，灌注到兩玻璃板之間，插入梳子，深度為1~1.2cm，等到*聚合，在最后的電泳溫度平衡凝膠。

　　(3)去掉底部的墊片，將凝膠裝到電泳槽，在頂部和底部槽中加入電泳緩沖液（25mmol/LTris堿和0.2mol/L甘氨酸），用吸管吹打毎個孔確保孔中的凝膠底部任何空間的氣泡被去除，在上樣以前300V預電泳凝膠不少于30min。

　　(4)上樣，300V電泳3h。

　　(5)倒空電泳槽，取下凝膠。所有的放射性物質(zhì)，包括RNA標記反應時未結(jié)合的核苷三磷酸仍然留在凝膠中，底部槽中的緩沖液應該沒有放射性，但是任何試驗參數(shù)發(fā)生了改變，必須測定底部糟中的緩沖液有沒有放射性（在任何情況下此操作都很有必要）。去掉一個玻璃板，依據(jù)定量的方法不同，凝膠可以置于Whatman濾紙上在凝膠干燥器中干燥，固定（12%甲醇，10%的乙酸）或直接用塑料膜包裹濕的凝膠直接進行定量。