介紹EMSA實(shí)驗(yàn)的三種方法

　　凝膠遷移或電泳遷移率實(shí)驗(yàn)(electrophoreticmobilityshiftassay,EMSA)是一種體外研究DNA結(jié)合蛋白（轉(zhuǎn)錄因子）和其相關(guān)的DNA結(jié)合序列（靶標(biāo)基因的啟動(dòng)子序列）相互作用的技術(shù)，可用于定性和定量分析。

　　通用蛋白質(zhì)-DNA結(jié)合分析試劑盒（比色），用于測(cè)量核提取物中轉(zhuǎn)錄因子與DNA結(jié)合活性。在實(shí)驗(yàn)中，含有靶向轉(zhuǎn)錄因子的DNA結(jié)合共有序列的標(biāo)記的雙鏈寡核苷酸（寡核苷酸）與結(jié)合試驗(yàn)緩沖液中的核提取物一起溫育。核提取物中活性形式的轉(zhuǎn)錄因子與其共有序列結(jié)合。然后將寡蛋白復(fù)合物捕獲到測(cè)定微孔上。靶蛋白可以通過(guò)高親和力抗體識(shí)別，并通過(guò)檢測(cè)抗體-顯色試劑反應(yīng)系統(tǒng)進(jìn)行比色測(cè)量。

　　EMSA實(shí)驗(yàn)根據(jù)實(shí)驗(yàn)方案設(shè)計(jì)的不同，分為驗(yàn)證型EMSA、競(jìng)爭(zhēng)型EMSA、超遷移EMSA。

　　一、驗(yàn)證型EMSA

　　用于驗(yàn)證探針是否含有可與蛋白質(zhì)結(jié)合的位點(diǎn)。

　　探針與純化蛋白混合孵育，探針與蛋白結(jié)合與否，可以直接表明探針和蛋白的互做關(guān)系。蛋白提取液中蛋白質(zhì)混雜，種類不單一，探針可能與多種蛋白結(jié)合。因此，探針與蛋白提取液混合孵育，可以驗(yàn)證探針上是否含有蛋白結(jié)合位點(diǎn)，但是無(wú)法得知是何種蛋白與探針結(jié)合。

　　二、競(jìng)爭(zhēng)型EMSA

　　與探針序列相同，不含修飾基團(tuán)的DNA的片段稱為冷探針。

　　在探針與蛋白質(zhì)混合液中加入大量冷探針，冷探針含有和探針相同的DNA序列，會(huì)干擾探針與蛋白的結(jié)合。在電泳圖的相應(yīng)位置處，電泳帶的的信號(hào)減弱或消失。

　　探針和蛋白的結(jié)合未必是特異性結(jié)合，或者蛋白本身可能含有，二者均能產(chǎn)生假陽(yáng)性的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。增加一個(gè)冷探針的干擾實(shí)驗(yàn)，可以排除假陽(yáng)性結(jié)果，增加實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。

　　三、超遷移EMSA

　　超遷移EMSA利用到了與待檢測(cè)的目的蛋白特異性結(jié)合的抗體。

　　如果蛋白質(zhì)溶液不是單一的純化蛋白，無(wú)論是驗(yàn)證型EMSA，還是競(jìng)爭(zhēng)型EMSA，都無(wú)法證明和探針結(jié)合的蛋白質(zhì)就是我們所預(yù)期的。在實(shí)驗(yàn)體系中引入特異性抗體，用抗體特異性地結(jié)合蛋白-探針復(fù)合物，這就是超遷移EMSA。

　　蛋白-探針復(fù)合物被抗體識(shí)別并結(jié)合，該三聚復(fù)合物在凝膠電泳中，遷移速率再次增大，電泳帶出現(xiàn)在蛋白-探針復(fù)合物的上方。

　　超遷移EMSA是以競(jìng)爭(zhēng)型EMSA為基礎(chǔ)的實(shí)驗(yàn)方案。超遷移EMSA的實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以很好的驗(yàn)證探針是否和蛋白結(jié)合，是否是特異性結(jié)合，與探針結(jié)合的蛋白是否是預(yù)期的蛋白質(zhì)。