在全球氣候變暖背景下，干旱已成為威脅植物生長(zhǎng)的重大挑戰(zhàn)。在植物中，根系是干旱脅迫信號(hào)的主要感知器，其發(fā)育直接影響抗旱能力。然而，在樹(shù)木中不定根（ARs）和側(cè)根（LRs）對(duì)非生物脅迫的協(xié)調(diào)反應(yīng)所依據(jù)的理論仍不清晰。
近日，東北林業(yè)大學(xué)-楊靜莉研究團(tuán)隊(duì)在Plant Physiology（IF=6.5）發(fā)表題為PuUBL5-mediated ZINC FINGER PROTEIN 1 stability is critical for root development under drought stress in Populus ussuriensis的研究論文，該研究借助DAP-seq技術(shù)揭示了楊樹(shù)通過(guò)“分子開(kāi)關(guān)"PuZFP1協(xié)調(diào)側(cè)根抑制與不定根伸長(zhǎng)的抗旱策略，為抗旱林木的遺傳改良提供了新的理論依據(jù)。
技術(shù)路線
研究結(jié)果
PuZFP1含有典型的C2H2鋅指結(jié)構(gòu)域（氨基酸43-65）和一個(gè)C端高度保守的EAR抑制基序（DLSLRL），與擬南芥AtZP1高度同源（結(jié)構(gòu)相似性＞60%），定位在細(xì)胞核與細(xì)胞質(zhì)。RT-qPCR和啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的GUS染色結(jié)果顯示，干旱和ABA處理顯著誘導(dǎo)PuZFP1表達(dá)，并且在于根系分化區(qū)（DZ）和伸長(zhǎng)區(qū)（EZ）特異性表達(dá)，與側(cè)根發(fā)生和不定根伸長(zhǎng)區(qū)域重疊。酵母轉(zhuǎn)錄激活實(shí)驗(yàn)和Gal4-GUS/LUC系統(tǒng)結(jié)果表明，PuZFP1是轉(zhuǎn)錄抑制因子，并且EAR基序是PuZFP1發(fā)揮轉(zhuǎn)錄抑制功能的必需結(jié)構(gòu)。通過(guò)構(gòu)建PuZFP1過(guò)表達(dá)（OE）和RNA干擾（RNAi）株系，發(fā)現(xiàn)PuZFP1負(fù)調(diào)控側(cè)根（LR）形成，正調(diào)控不定根（AR）伸長(zhǎng)，在楊樹(shù)根系響應(yīng)干旱脅迫中發(fā)揮關(guān)鍵調(diào)控作用。
圖1. PuZFP1的生物信息學(xué)和表達(dá)模式分析。
圖2. PuZFP1賦予楊樹(shù)抗旱能力。
圖3. PuZFP1賦予楊樹(shù)抗旱能力。
進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，PuZFP1的穩(wěn)定性受泛素樣蛋白PuUBL5調(diào)控。酵母雙雜交（Y2H）、雙分子熒光互補(bǔ)（BiFC）和Pull-down實(shí)驗(yàn)證實(shí)，PuZFP1與PuUBL5直接互作，且PuZFP1通過(guò)26S 蛋白酶體途徑降解。蛋白酶體抑制劑MG132處理實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步表明，阻斷蛋白酶體途徑可顯著抑制PuZFP1降解，驗(yàn)證了該降解機(jī)制的依賴性。
圖4. PuZFP1與PuUBL5相互作用，并發(fā)生PuUBL5介導(dǎo)的降解。
為確定PuZFP1的靶基因，研究團(tuán)隊(duì)將DAP-seq和RNA-seq聯(lián)合分析，鑒定出PuZFP1的下游靶基因PuWRKY46和 PuEGR1。DAP-seq結(jié)果顯示，PuZFP1主要結(jié)合在轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)（TSS）附近，在所有的結(jié)合峰中，啟動(dòng)子區(qū)占比19%，基因間區(qū)占比65%。雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)表明，PuZFP1對(duì)這兩個(gè)基因的啟動(dòng)子具有轉(zhuǎn)錄抑制作用，同時(shí)ABA處理抑制了PuZFP1與靶基因啟動(dòng)子的結(jié)合。
結(jié)合EMSA實(shí)驗(yàn)和靶基因功能研究發(fā)現(xiàn)PuZFP1通過(guò)結(jié)合PuWRKY46啟動(dòng)子中的CAGTG元件抑制其轉(zhuǎn)錄，進(jìn)而阻斷側(cè)根原基形成；同時(shí)，通過(guò)抑制PuEGR1（含TTTTGTTT結(jié)合基序）的表達(dá)，解除對(duì)不定根伸長(zhǎng)區(qū)（EZ）細(xì)胞伸長(zhǎng)的抑制。
圖5. PuZFP1靶基因的鑒定和直接結(jié)合驗(yàn)證。
圖6. PuWRKY46楊樹(shù)抗旱能力。
圖7. PuEGR1賦予楊樹(shù)抗旱能力。
結(jié)合激素信號(hào)分析結(jié)果，發(fā)現(xiàn)PuZFP1通過(guò)協(xié)調(diào)脫落酸（ABA）與生長(zhǎng)素（IAA）信號(hào)通路，雙向調(diào)控根系發(fā)育：在根系分化區(qū)（DZ），PuZFP1抑制靶基因PuWRKY46的表達(dá)，導(dǎo)致該區(qū)ABA含量升高、IAA含量降低，ABA/IAA比例升高，從而抑制側(cè)根（LR）原基的形成與萌發(fā)；而在伸長(zhǎng)區(qū)（EZ），PuZFP1抑制PuEGR1的表達(dá)，使該區(qū)ABA含量降低、IAA含量升高，ABA/IAA比例降低，進(jìn)而促進(jìn)不定根（AR）細(xì)胞的伸長(zhǎng)。這種ABA與生長(zhǎng)素的時(shí)空比例調(diào)控，是PuZFP1介導(dǎo)根系結(jié)構(gòu)適應(yīng)干旱脅迫的核心機(jī)制。
圖8. PuZFP1表達(dá)與ABA/auxin途徑聯(lián)合調(diào)控根系發(fā)育。
綜上所述，本研究揭示了PuUBL5-PuZFP1模塊通過(guò)ABA /auxin信號(hào)調(diào)控根系發(fā)育的機(jī)制，為楊樹(shù)抗旱分子育種提供了理論依據(jù)。
圖9. 楊樹(shù)PuZFP1-PuUBL5模塊響應(yīng)干旱脅迫下的模型。
藍(lán)景科信擁有200+物種，3000+轉(zhuǎn)錄因子的實(shí)驗(yàn)經(jīng)驗(yàn)，周期短，口碑好，助力客戶發(fā)表高分文章Cell，Molecular Plant，Plant Biotechnology Journal，The Plant Cell，Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，Plant Communications，Journal of Integrative Plant Biology，New Phytologist，International Journal of Biological Macromolecules，Horticulture Research，Plant Physiology等。
咨詢電話