在生物學研究中，系統發育分析是揭示物種進化關系的核心手段，而MEGA（Molecular Evolutionary Genetics Analysis）軟件憑借其強大功能與友好界面，成為科研人構建系統發育樹的得力助手。無論是剛入門的科研小白，還是想提升分析效率的老手，這篇全流程教程都能幫你輕松掌握MEGA系統發育分析的核心操作！
一、前期準備：數據與軟件就位
1. 數據獲取
首先，需要準備用于分析的序列數據，可以是DNA、RNA或蛋白質序列。常見的數據來源包括NCBI數據庫、Ensembl數據庫等。下載數據時，建議將序列保存為FASTA格式，該格式以“>"開頭標注序列名稱，后續MEGA軟件能直接識別。
2. MEGA軟件安裝
前往MEGA網站下載對應系統版本（Windows、Mac或Linux），安裝過程一路默認即可。目前最新版本為MEGA 12，功能更強大，操作更流暢。
MEGA軟件的頁面如下圖所示，選擇對應系統和版本后，點擊DOWNLOAD按鈕進行軟件下載。
用戶協議頁面，下拉到最后點擊Accept跳轉到下一個頁面：
填寫完畢相關信息后，繼續點擊DOWNLOAD。
彈出此頁面后稍等幾秒鐘即可開始下載，下載完畢后安裝即可使用：
二、實戰操作：從序列比對到進化樹構建
總共分為4步：序列導入，序列比對，系統發育樹構建，結果保存。接下來請看詳細步驟。
1. 序列導入
（1）首先需要準備一個fasta格式的序列文件，里面是需要進行比對的序列。
（2）打開MEGA軟件，點擊菜單欄“File"→“Open A File/Session"，選擇已準備好的FASTA文件，點擊align進行比對。導入后，數據會顯示在主窗口中，此時可先檢查序列長度、名稱是否正確。
（3）點擊后的頁面如下，點擊“File"→“Font"可以對字體進行調節。
2. 序列比對
（1）多序列比對（Multiple Sequence Alignment）：點擊“Alignment"→“Align by ClustalW"或“Align by MUSCLE"，軟件將快速完成比對。
（2）這里以ClustalW為例，上方點擊Align by ClustalW后，出現如下的參數選擇頁面，一般情況下全部使用默認參數即可，點擊右下角的OK選項進行比對。
（3）比對完成后界面如下，比對完成的序列可以通過點擊“Data"→“Save Session"保存比對結果，格式為“.meg"。
3.系統發育樹構建
（1）選擇建樹方法：點擊“Phylogeny"，常見方法有鄰接法（Neighbor-Joining, NJ）、最大似然法（Maximum Likelihood, ML）等。NJ法計算快，適合初步分析；ML法更精確，適合復雜數據集。
（2）參數設置：以NJ法為例，點擊“Construct/Test Neighbor-Joining Tree"，在彈出窗口中，“Test of Phylogeny"選擇“Bootstrap method"，一般設置1000次重復以評估樹的可靠性；選擇用p-distance方法進行計算，其他參數保持默認即可。
（3）這樣，我們就得到了系統發育樹圖。注意這里有兩張圖，第一張original tree是可以通過分支長度表達遺傳距離的圖，第二張bootstrap consensus tree是有自展值的圖。一般情況下選用origin tree圖即可。
進化樹解讀
l 分支長度：代表序列間的進化距離，越長說明差異越大。
l Bootstrap值：分支上的數值（如>70%）越高，表明該分支可靠性越強。
l 聚類關系：同一分支的物種親緣關系更近，反映進化歷程。
（4）通過菜單欄和左側的工具欄，可對生成的系統發育樹進行美化，這里選擇把系統發育樹從長條狀變成圓形，同時也可以編輯分支的粗細和字體等。
4. 結果保存
（1）保存樹文件：點擊“File"→“Export Current Tree (Newick)"，選擇“.nwk"格式，方便后續用其他軟件編輯。
（2）保存圖片：右鍵點擊樹圖空白處，選擇“Copy to Clipboard"或“Export Image"，支持PNG、PDF等格式，滿足論文投稿或匯報需求。
保存選項可以選擇是否保留分支長度和自展值，建議都勾選上。
（3）最后推薦一個可以美化進化樹的在線iTOL，上傳保存的進化樹文件后，可以進行更加精細的美化。
三、避坑指南：新手常見問題解決
序列比對錯亂：檢查序列是否有非標準字符（如空格、特殊符號），或嘗試更換比對算法。
Bootstrap值過低：可能是數據量不足或序列差異過大，可增加樣本或調整建樹方法。
軟件閃退：關閉不必要的后臺程序，或嘗試降低參數（如減少Bootstrap重復次數）。
四、文獻案例
文章標題：Anther-specific expression of MsMYB35 transcription factor in alfalfa (Medicago sativa L.) and its crucial role in pollen development
中文：紫花苜蓿中MsMYB35轉錄因子的花藥特異性表達及其在花粉發育中的關鍵作用
發表年份：2025年
期刊：The Plant Journal
研究背景：
紫花苜蓿（Medicago sativa L.）是一種優質的飼料作物，是畜牧業的重要資源。了解紫花苜蓿雄性不育的分子機制對于開發優質牧草品種至關重要。盡管花藥發育在植物繁殖中起著關鍵作用，但其分子調控機制，特別是轉錄因子在苜蓿中的參與仍未得到充分探索。
研究結果：
首先通過Protein BLAST，顯示MsMYB35與其他物種的MYB35家族成員具有高度序列相似性，系統發育分析顯示MsMYB35與擬南芥的MYB轉錄因子密切相關。此外，系統發育樹使用了來自多個物種的同系物進行樹木分析，結果（圖1A）表明MsMYB35與MtMYB35、PsMYB35、TrMYB35和GmMYB35 密切相關，形成一個具有高bootstrap值的強進化枝 （100），表明具有相當大的進化相似性。將MsMYB35與M. truncatula、Melilotus albus、G. max、P. sativum、T. repens和A. officinalis的氨基酸序列進行同源氨基酸序列比對。結果表明，MsMYB35包含R2R3-MYB家族的經典R2R3結構域（圖1B）。
基于對MsMYB35蛋白N端R2R3結構域的鑒定，將其歸入R2R3-MYB轉錄因子家族。綜合DAP-seq和RNA-seq分析顯示，MsMYB35直接調控兩個關鍵的花藥發育相關基因。功能分析表明，MsMYB35的過表達促進花藥發育，而沉默MsMYB35會導致花藥囊缺陷和花粉粒起皺。適當的MsMYB35表達可確保形成有活力和可育的花粉粒，鞏固其作為花藥發育關鍵調節因子的作用。
圖1. MsMYB35的氨基酸序列比對和系統發育分析。
根據以上內容可以看出，系統發育分析的意義在于它幫助我們理解物種之間的進化關系。通過構建系統發育樹，我們可以直觀地展示不同物種或同一物種不同族群之間的親緣關系。這種分析不僅用于研究物種的起源和演化，還能為生物分類、生態學研究和疾病控制提供重要信息。系統發育分析通過數理統計方法，能夠揭示生物間的相似性和差異性，從而為生物學研究提供科學依據。
參考文獻：
Cai H, Zhang S, Wang Y, Yang Z, Zhang L, Zhang J, Zhang M, Xu B. Anther-specific expression of MsMYB35 transcription factor in alfalfa (Medicago sativa L.) and its crucial role in pollen development. Plant J. 2025 Apr;122(1):e70126.
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