2025年8月，北京林業(yè)大學(xué)林木花卉遺傳育種教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室的研究團(tuán)隊(duì)在《Environmental and Experimental Botany》發(fā)表一篇題為“PeCPK21 interacts with HMAPs to tolerate elevated cadmium stress in Populus × canescens"的研究論文。該研究借助HaloTag pull-down和質(zhì)譜分析，揭示了PeCPK21作為Cd2?信號(hào)傳感器，通過(guò)與HMAPs互作從多維度增強(qiáng)楊樹(shù)耐鎘性的分子機(jī)制，為林木耐鎘基因工程提供了重要靶點(diǎn)。
研究背景
鎘（Cd2?）作為一種高毒性重金屬污染物，可通過(guò)土壤-植物系統(tǒng)進(jìn)入食物鏈，對(duì)生態(tài)系統(tǒng)穩(wěn)定性和人類(lèi)健康構(gòu)成嚴(yán)重威脅。植物修復(fù)技術(shù)因成本低、環(huán)境友好等特點(diǎn)，成為治理鎘污染土壤的重要手段。楊樹(shù)作為速生樹(shù)種，具有生物量大、根系與地上部分鎘吸收能力強(qiáng)等優(yōu)勢(shì)，在鎘污染土壤修復(fù)中展現(xiàn)出巨大潛力。然而，高濃度鎘脅迫會(huì)對(duì)楊樹(shù)造成顯著毒性，導(dǎo)致葉綠體和線粒體結(jié)構(gòu)畸形，抑制生長(zhǎng)與光合作用，限制其修復(fù)效率。因此，通過(guò)基因工程手段提高楊樹(shù)的鎘耐受性成為當(dāng)前研究熱點(diǎn)。鈣依賴蛋白激酶（CPKs）作為鈣信號(hào)傳感器，在植物應(yīng)對(duì)鎘脅迫中發(fā)揮關(guān)鍵作用。擬南芥中，AtCPK21和AtCPK23通過(guò)磷酸化轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白NRAMP6限制鎘積累。前期研究發(fā)現(xiàn)，胡楊PeCPK21在擬南芥中可與重金屬轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)蛋白及轉(zhuǎn)錄因子AtNFYC3互作，通過(guò)減少鎘積累和增強(qiáng)抗氧化系統(tǒng)提高耐受性。然而，PeCPK21在楊樹(shù)中是否通過(guò)與重金屬脅迫相關(guān)蛋白（HMAPs）互作調(diào)控鎘耐受性，其具體分子機(jī)制仍不明確。
主要研究結(jié)果
1 PeCPK21提高楊樹(shù)鎘耐受性本研究選擇18個(gè)PeCPK21轉(zhuǎn)基因雜交楊品系，旨在明確其在鎘脅迫下的作用。RT-qPCR、Western blot 結(jié)果顯示OE10株系的蛋白表達(dá)量最高，OE7株系較低。隨后，作者選取OE1、OE6、OE10 這3個(gè)轉(zhuǎn)基因株系進(jìn)行后續(xù)鎘耐受性檢測(cè)。在500 μM CdCl?處理30 d后，過(guò)表達(dá)株系（OE1、OE6、OE10）株高和莖粗增量顯著高于野生型（WT），而REL（相對(duì)電導(dǎo)率）顯著低于WT。結(jié)果表明，PeCPK21過(guò)表達(dá)能夠增強(qiáng)楊樹(shù)鎘耐受性。
2 鎘對(duì)光合與蒸騰的影響
為了研究鎘對(duì)PeCPK21轉(zhuǎn)基因楊樹(shù)光合作用與蒸騰作用的影響，作者進(jìn)一步檢測(cè)了光合參數(shù)（Pn、E、Cleaf），葉綠素含量及熒光指標(biāo)（Fv/Fm、YII、ETR）。結(jié)果顯示，OE1、OE6、OE10 的 Pn、E、Cleaf值比野生型高17%–32%，表明PeCPK21過(guò)表達(dá)可緩解鎘脅迫對(duì)氣孔功能和碳同化的抑制；葉綠素含量及Fv/Fm、YII、ETR的下降幅度均小于野生型，表明PeCPK21可減輕鎘對(duì)光合色素和光反應(yīng)系統(tǒng)的損傷。綜上所述，PeCPK21過(guò)表達(dá)可緩解鎘對(duì)光合系統(tǒng)的抑制。
3 鎘對(duì)ROS與抗氧化酶的影響
Cd2+積累促進(jìn)植物細(xì)胞產(chǎn)生ROS。作者采用DAB和NBT染色檢測(cè)H?O?和O??含量，并通過(guò)試劑盒測(cè)定POD、CAT、SOD活性及相關(guān)基因表達(dá)。結(jié)果顯示，CdCl?處理后，轉(zhuǎn)基因株系ROS積累更少，POD、CAT、SOD活性及對(duì)應(yīng)基因（PcPODa2、PcCAT1等）表達(dá)量顯著高于WT，表明PeCPK21過(guò)表達(dá)能夠增強(qiáng)楊樹(shù)抗氧化防御能力。
4 鎘的吸收與運(yùn)輸
為進(jìn)一步研究鎘脅迫對(duì)Cd2?吸收與轉(zhuǎn)運(yùn)的影響，作者采用原子吸收光譜測(cè)定根、莖、葉鎘含量，非損傷微測(cè)技術(shù)（NMT）測(cè)定根尖鎘通量。結(jié)果顯示，CdCl?處理后，轉(zhuǎn)基因株系全株鎘積累量及各器官鎘含量顯著低于WT，根尖Cd2?凈流入量減少41%-51%，表明PeCPK21過(guò)表達(dá)能夠限制楊樹(shù)對(duì)鎘的吸收與轉(zhuǎn)運(yùn)。
5 PeCPK21互作蛋白鑒定
為深入探究與PeCPK21互作的蛋白，作者采用HaloTag pull-down、SDS-PAGE、LC-MS/MS技術(shù)進(jìn)行富集-分離-鑒定，共鑒定到四類(lèi)互作蛋白：
（a）重金屬轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)蛋白：例如銅轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（PcATX1）、鈣依賴蛋白激酶（PcCPK2、PcCPK23）以及木葡聚糖內(nèi)轉(zhuǎn)糖苷酶/水解酶蛋白6（PcXTH6）；
（b）光合相關(guān)蛋白：包括高葉綠素?zé)晒獾鞍?/span>136（PcHCF136，定位于葉綠體）、光系統(tǒng)Ⅱ10 kDa 多肽（PcPsbR）、捕光復(fù)合體類(lèi)似蛋白（PcOHP1）、光合NDH復(fù)合體腔側(cè)亞基5（PcPNSL5）、類(lèi)囊體彎曲蛋白1A/1B/1C（PcCURT1A/1B/1C，定位于葉綠體）、ATP 合酶α亞基（PcatpA，定位于葉綠體）以及ATP合酶δ亞基（PcATPD，定位于葉綠體）；
（c）膜內(nèi)在蛋白：如質(zhì)膜內(nèi)在蛋白2-5（PcPIP2-5）、液泡膜內(nèi)在蛋白1-3（PcTIP1-3）和液泡膜內(nèi)在蛋白2-1（PcTIP2-1）；
（d）抗氧化酶：包括鐵型超氧化物歧化酶（PcSOD[Fe]）和L-抗壞血酸過(guò)氧化物酶（PcAPX2）。
6 PeCPK21相互作用蛋白的轉(zhuǎn)錄本分析
作者采用RT-qPCR檢測(cè)了CdCl2處理后野生型（WT）和3個(gè)轉(zhuǎn)基因株系與PeCPK21相互作用的重金屬脅迫相關(guān)蛋白（HMAPs）的表達(dá)情況。結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)基因株系中光合相關(guān)基因（PcHCF136、PcatpA）、重金屬轉(zhuǎn)運(yùn)基因（PcATX1、PcCPK2、PcCPK23和PcXTH6）、抗氧化酶基因（PcAPX2、PcSOD [Fe]）、膜內(nèi)在蛋白基因（PcPIP2-5、PcTIP1-3和PcTIP2-1）的表達(dá)量顯著高于WT，且這種高表達(dá)更利于楊樹(shù)應(yīng)對(duì)鎘脅迫。
7 PeCPK21與PcXTH6互作及功能
作者采用HaloTag pull-down、Co-IP、LCI進(jìn)一步驗(yàn)證PeCPK21與PcXTH6互作，并構(gòu)建過(guò)PcXTH6表達(dá)株系，測(cè)定其鎘含量、木葡聚糖降解活性（XDA）及木葡聚糖含量。結(jié)果顯示，PeCPK21與PcXTH6直接互作，過(guò)表達(dá)PcXTH6可通過(guò)提高XDA、降低木葡聚糖含量，減少細(xì)胞壁上的 Cd2?結(jié)合位點(diǎn)，從而降低楊樹(shù)對(duì)鎘的吸收與積累。
8 PeCPK21與PcSOD [Fe]互作及功能
在CdCl?處理后下，PeCPK21轉(zhuǎn)基因楊樹(shù)維持了較高的PcSOD[Fe]表達(dá)水平，這表明PeCPK21可通過(guò)與抗氧化酶相互作用來(lái)維持ROS穩(wěn)態(tài)。為明確PcSOD[Fe]在Cd2?脅迫下抗氧化防御中的積極作用，作者進(jìn)一步構(gòu)建了PcSOD[Fe]過(guò)表達(dá)株系，并測(cè)定其ROS含量及抗氧化酶活性。結(jié)果顯示，PeCPK21與PcSOD[Fe]互作，過(guò)表達(dá)PcSOD[Fe] 能顯著提高鎘脅迫下POD、CAT、SOD活性，減少ROS積累，增強(qiáng)楊樹(shù)的鎘耐受性。
結(jié)論
本文綜合運(yùn)用基因過(guò)表達(dá)、分子互作驗(yàn)證、生理與分子指標(biāo)測(cè)定等方法，證實(shí)PeCPK21通過(guò)與HMAPs（重金屬轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)蛋白、光合相關(guān)蛋白、膜內(nèi)在蛋白、抗氧化酶）相互作用，限制Cd2?積累、增強(qiáng)ROS清除能力、維持光合效率與水分平衡，從而提高歐洲山楊×銀白楊對(duì)高濃度鎘脅迫的耐受性，為木本植物鎘耐受遺傳改良提供理論依據(jù)。
藍(lán)景科信HaloTag pull-down優(yōu)勢(shì)：
1、采用真核無(wú)細(xì)胞蛋白表達(dá)系統(tǒng)，表達(dá)蛋白可進(jìn)行翻譯后修飾，更接近體內(nèi)真實(shí)蛋白狀態(tài)。
2、無(wú)需轉(zhuǎn)化和鑒定，可直接表達(dá)目的蛋白，節(jié)省實(shí)驗(yàn)時(shí)間。
3、蛋白表達(dá)成功率高，系統(tǒng)模擬真核細(xì)胞折疊環(huán)境、無(wú)活細(xì)胞內(nèi)空間擁擠限制，表達(dá)產(chǎn)物無(wú)包涵體。
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