Polysome profiling下游實驗 | 附文獻分享

Polysome profiling是基于蔗糖密度梯度離心，將細胞質RNA分離成多個組分：游離RNA,結合核糖體40S或60S亞基、單核糖體(80S)或多聚核糖體等。后續可以分別收集40S、60S、80S和多聚核糖體，用于RNA或蛋白質分析，也可以通過酶消化檢測disome等等。

1：Disome/Trisome-seq  

在polysome profiling基礎上進行酶切處理，酶切去除未被核糖體保護的mRNA，只測序核糖體保護的短片段（RPF）；通過發現disome或trisome的變化來檢測核糖體碰撞(collision)與翻譯停滯(stalling)現象。

文獻案例：突變亨廷頓蛋白在亨廷頓病細胞模型中阻滯核糖體并抑制蛋白質合成

文章題目：Mutant Huntingtin stalls ribosomes and represses protein synthesis in a cellular model of Huntington disease

這篇研究論文主要探討了亨廷頓病（Huntington's disease, HD）中突變亨廷頓蛋白（mutant huntingtin, mHTT）如何通過影響核糖體功能和蛋白質合成來導致神經退行性病變的機制，為理解HD的發病機制和開發治療方法提供了重要線索。

 Hectd1 HD 細胞蛋白質合成抑制和核糖體停滯

文獻案例：Disome-seq揭示了促進共翻譯蛋白折疊的廣泛核糖體碰撞成

文章題目：Disome-seq reveals widespread ribosome collisions that promote cotranslational protein folding

研究通過創新的 Disome-seq 技術（測序雙核糖體保護的 mRNA 片段），系統揭示了酵母細胞中廣泛存在的核糖體碰撞現象及其在蛋白質折疊調控中的關鍵作用。該研究證明核糖體碰撞是細胞調控蛋白質穩態的普遍策略，通過序列特異的翻譯暫停和伴侶蛋白協同，確保新生肽鏈的正確折疊，為理解蛋白質折疊疾病（如神經退行性疾病）提供了新視角。

 Disome-seq 測定核糖體碰撞

2：Polysome-seq 多聚核糖體結合轉錄本測序

在polysome profiling的基礎上，提取多聚核糖體各組分樣本中的RNA，進行RNA-seq測序，深入分析特定mRNA的翻譯狀態和多聚核糖體分布特征。

文獻案例：RNA 結合蛋白 PRRC2B 介導特定 mRNA 的翻譯并調節細胞周期進程

文章題目：RNA binding protein PRRC2B mediates translation of specific mRNAs and regulates cell cycle progression

PRRC2B 通過結合特定 mRNA 的 5'UTR 區，招募 eIF4G2/eIF3 復合物促進翻譯，進而驅動細胞周期進程。技術借鑒：整合 PAR-CLIP、多核糖體測序、質譜互作組分析等技術。該研究揭示了 RNA 結合蛋白在翻譯調控中的新機制，為癌癥治療提供了潛在靶點。

 PRRC2B 結合的 mRNA 在 PRRC2B 敲除后表現出翻譯效率降低

注：A 圖為 Polysome profiling 流程示意圖，D 和 E 圖為 Polysome-seq 分析翻譯效率差異圖，F 和 G 圖為 Polysome-qPCR 分析特定基因翻譯效率圖。 

3：Polysome profiling+RT-qPCR

梯度分離多聚核糖體區域后，用RT-qPCR定量特定基因在各組分的分布，可用于目標基因翻譯活躍度驗證，藥物或處理條件下翻譯變化監測

[內參法}文獻案例：利用多聚核糖體譜分析和定量PCR鑒定懸浮細胞系中潛在的微肽編碼長鏈非編碼RNA

文章題目：Polysome profiling followed by quantitative PCR for identifying potential micropeptide encoding long non-coding RNAs in suspension cell lines

該研究是通過懸浮細胞系中的多核糖體分析來篩選潛在的微肽編碼lncRNA。當與定量PCR相結合，有助于同時識別許多翻譯lncRNA。

作者在完成polysome分離后，對各組分進行了RNA提取和cDNA反轉錄。在通過 RT-qPCR篩選可能翻譯的lncRNA時，設置了陽性和陰性對照，以評價結果的穩健性。GAPDH等管家基因的mRNA可作為陽性對照；已知的細胞質非編碼RNA，如hY1，可以作為陰性對照。GAPDH的峰值應位于高多核組分中，而hY1應富集在亞單體組分中。在 polysome組分中具有突出峰值的候選lncRNA可能表明在細胞中激活翻譯。

qPCR數據分析

每個組分中RNA百分比的計算如下：

X = 計算的組分數；Y= 組分數總數。

注：A 圖為 Polysome profiling多聚核糖體譜，B 圖為 Polysome-qPCR結果：目標lncRNA的分布。蛋白質編碼mRNA GAPDH用作陽性對照。非編碼RNA hY1用作陰性對照。

【外參法】文獻案例：利用多聚核糖體分析翻譯過程中mRNA及其相關蛋白

文章題目：Polysome Profiling Analysis of mRNA and Associated Proteins Engaged in Translation

本方案包括從梯度組分中提取RNA，然后進行逆轉錄和定量PCR (RT-qPCR)、qPCR數據處理。其中引入了熒光素酶RNA（FLuc RNA）做標準化。

qPCR數據分析

在所有組分中檢測到的目的轉錄本的總數設置為100%，每個組分中目的轉錄本的比例用百分比表示。

4：Polysome profiling+WB

WB/質譜驗證翻譯活性，還可分析翻譯調控因子的功能

文獻案例：HectD1通過調控核糖體組裝和蛋白質合成來控制造血干細胞再生

文章題目：HectD1 controls hematopoietic stem cell regeneration by coordinating ribosome assembly and protein synthesis

HectD1 通過泛素化降解 ZNF622，調控核糖體組裝和蛋白質翻譯效率，從而維持 HSC 在應激條件下的再生能力。理論意義：揭示泛素化修飾在核糖體組裝和 HSC 再生中的關鍵作用，為理解核糖體病的發病機制提供了新視角。臨床意義：ZNF622 可能是治療骨髓衰竭綜合征（如 Shwachman-Diamond 綜合征）的潛在靶點。

Hectd1 缺失導致 ZNF622 和 eIF6 在 60S 中積累，核糖體亞基連接減少，ZNF622 耗竭后恢復

注：A、B 圖為 Polysome profiling 峰圖，C、D 圖為 Polysome profiling 的 western blot 分析圖。

參考文獻

1.Eshraghi M, Karunadharma PP, Blin J, Shahani N, Ricci EP, Michel A, Urban NT, Galli N, Sharma M, Ramírez-Jarquín UN, Florescu K, Hernandez J, Subramaniam S. Mutant Huntingtin stalls ribosomes and represses protein synthesis in a cellular model of Huntington disease. Nat Commun. 2021 Mar 5;12(1):1461.

2.Zhao T, Chen YM, Li Y, Wang J, Chen S, Gao N, Qian W. Disome-seq reveals widespread ribosome collisions that promote cotranslational protein folding. Genome Biol. 2021 Jan 5;22(1):16.

3.Jiang F, Hedaya OM, Khor E, Wu J, Auguste M, Yao P. RNA binding protein PRRC2B mediates translation of specific mRNAs and regulates cell cycle progression. Nucleic Acids Res. 2023 Jun 23;51(11):5831-5846.

4.Pringle ES, McCormick C, Cheng Z. Polysome Profiling Analysis of mRNA and Associated Proteins Engaged in Translation. Curr Protoc Mol Biol. 2019 Jan;125(1):e79.

5.Han C, Sun L, Pan Q, Sun Y, Wang W, Chen Y. Polysome profiling followed by quantitative PCR for identifying potential micropeptide encoding long non-coding RNAs in suspension cell lines. STAR Protoc. 2021 Dec 14;3(1):101037.

6.Lv K, Gong C, Antony C, Han X, Ren JG, Donaghy R, Cheng Y, Pellegrino S, Warren AJ, Paralkar VR, Tong W. HectD1 controls hematopoietic stem cell regeneration by coordinating ribosome assembly and protein synthesis. Cell Stem Cell. 2021 Jul 1;28(7):1275-1290.e9.

7.Ryder L, Arendrup FS, Martínez JF, Snieckute G, Pecorari C, Shah RA, Lund AH, Blasius M, Bekker-Jensen S. Nitric oxide-induced ribosome collision activates ribosomal surveillance mechanisms. Cell Death Dis. 2023 Jul 26;14(7):467.

8.Rodriguez-Martinez A, Young-Baird SK. Polysome profiling is an extensible tool for the analysis of bulk protein synthesis, ribosome biogenesis, and the specific steps in translation. Mol Biol Cell. 2025 Apr 1;36(4):mr2.