微生物鑒定與微生物多樣性測序結合解析復雜樣本中的稀有菌群
更新時間：2026-01-30 點擊次數：7次
在現代微生物學研究中，復雜環境樣本（如土壤、腸道內容物、海洋沉積物或臨床標本）中往往包含成百上千種微生物，其中絕大多數為豐度極低的“稀有菌群”（rare biosphere）。這些稀有菌群雖占比微小，卻可能在生態系統功能維持、宿主健康調控甚至疾病發生中扮演關鍵角色。然而，傳統培養方法對大多數不可培養微生物束手無策，而單一的高通量測序技術又難以準確鑒定低豐度物種。因此，將經典微生物鑒定手段與新一代微生物多樣性測序技術有機結合，成為深入解析復雜樣本中稀有菌群結構與功能的有效策略。
一、稀有菌群的研究價值與挑戰
稀有菌群通常指在微生物群落中相對豐度低于0.1%甚至更低的類群。盡管其數量稀少，但研究表明，它們具有高度的系統發育多樣性，是微生物“種子庫”的重要組成部分。在環境擾動（如抗生素使用、氣候變化或污染事件）后，部分稀有菌可能迅速增殖，成為優勢種群，從而重塑整個微生物生態網絡。此外，在人體腸道中，某些稀有致病菌或條件致病菌在特定條件下可引發感染或慢性炎癥，因此對其精準識別具有重要的臨床意義。
然而，稀有菌群的檢測面臨多重挑戰：首先，高通量測序（如16S rRNA基因擴增子測序）雖然能提供群落整體結構信息，但在低豐度區域易受PCR擴增偏差、測序錯誤及數據庫不完整等因素干擾，導致假陽性或假陰性；其次，宏基因組測序雖可繞過擴增步驟，但對稀有物種的覆蓋深度不足，難以實現可靠組裝和注釋；再者，缺乏有效的富集或分離手段，使得稀有菌難以被單獨研究其生理特性。
二、微生物鑒定與多樣性測序的互補優勢
傳統微生物鑒定方法，包括形態學觀察、生化試驗、質譜分析（如MALDI-TOF MS）以及特異性PCR等，雖通量較低，但具有高特異性和準確性，尤其適用于已知目標菌的確認。而高通量多樣性測序則擅長全景式描繪群落組成，揭示未知類群的存在。兩者結合，可形成“廣篩+精鑒”的研究范式。
例如，在初步通過16S rRNA擴增子測序發現某臨床樣本中存在潛在致病稀有菌（Elizabethkingia屬）后，可設計特異性引物進行qPCR定量，并結合培養富集與MALDI-TOF MS驗證其存在與活性。這種策略不僅提高了鑒定的可信度，還能排除測序背景噪音的干擾。
更進一步，近年來發展的靶向富集測序（如基于探針捕獲的16S或全基因組富集）技術，可在測序前對目標稀有菌DNA進行富集，顯著提升其在測序數據中的比例，從而提高檢測靈敏度。在此基礎上，結合單細胞分選與全基因組擴增（scWGA），甚至可對無法培養的稀有菌進行基因組水平的解析。
三、整合策略的實際應用案例
在一項關于早產兒腸道菌群的研究中，研究者首先利用16S rRNA測序發現多個低豐度Clostridioides difficile信號，但無法確定是否為活菌或污染。隨后，他們采用厭氧培養結合特異性毒素基因PCR，成功分離出活的產毒菌株，并通過全基因組測序確認其毒力基因型。這一整合方法不僅證實了稀有致病菌的存在，還揭示了其潛在致病風險，為臨床干預提供了依據。
另一項海洋微生物研究則采用宏基因組測序結合熒光原位雜交（FISH）技術，對深海沉積物中豐度極低的古菌類群進行可視化定位與功能注釋。通過設計針對特定16S序列的FISH探針，研究者在顯微鏡下直接觀察到這些稀有古菌的空間分布，并結合宏基因組binning重建其代謝通路，揭示其在氮循環中的潛在作用。
四、未來展望
隨著長讀長測序、單細胞多組學及人工智能輔助分類算法的發展，微生物鑒定與微生物多樣性測序的融合將更加緊密。未來的研究可構建“從群落到單細胞再到功能驗證”的完整鏈條，實現對稀有菌群從存在性確認到生態功能解析的全鏈條研究。 面對復雜樣本中稀有菌群這一“暗物質”，唯有打破技術壁壘，整合多維度方法，才能真正揭開其神秘面紗，為環境微生物學、醫學微生物學及合成生物學等領域提供新的認知基礎與應用潛力。
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