【文獻解讀】ChIP-seq應用：解鎖地錢葉綠體發(fā)育調控密碼

文獻速遞

葉綠體作為植物光合作用的“能量工廠"，其從原始質體到功能完善結構的發(fā)育過程，受核編碼轉錄因子精密調控。目前，被子植物（如擬南芥）中的調控機制已被逐步揭開，但在非種子植物中，這些關鍵調控因子的功能是否“代代相傳"，始終是未解之謎。

2024年12月，發(fā)表在Cell Reports上的一篇題為“Streamlined regulation of chloroplast development in the liverwort Marchantia polymorpha》"的研究論文，以地錢為對象，探究了已知葉綠體生物發(fā)生調控因子（GLK、GATAs、HY5、SCL-MIR171模塊）的功能保守性。該研究借助ChIP-seq明確了MpGLK的直接靶標基因、結合基序及調控特征，聯合ATAC-seq共同揭示了MpGLK的結合特性及與開花植物的保守性和分化。

技術路線

研究結果

該研究通過系統(tǒng)發(fā)育分析，在地錢中鑒定出被子植物HY5、GLK、GATA和SCL的同源基因，分別為MpGATA4、MpGATA2、MpSCL和MpGLK。隨后，作者構建了MpGATA4、MpGATA2、MpSCL-MIR171、MpHY5及MpGLK的敲除突變體，發(fā)現地錢中MpGATA4與MpGATA2的缺失，對葉綠素合成及葉綠體發(fā)生無顯著影響，與擬南芥中同源基因的功能不保守；MpSCL不調控葉綠素含量，僅部分株系葉綠體變大，這也與擬南芥中的情況存在差異；而Mphy5突變體在低溫下會出現葉綠素含量降低的條件性表型，Mpglk突變體則表現出葉綠素積累減少、葉綠體變小的特征，二者均與擬南芥類似。綜上表明，GLK在地錢葉綠體生物發(fā)生中具有高度保守的功能，HY5的條件性作用也具備保守性。

圖1. MpGLK、MpGATAs、MpMIR171、MpSCL和MpHY5的敲除突變體

圖2. Mpglk調控葉綠體大小與超微結構

為驗證MpGATA4、MpGATA2、MpSCL和MpHY5功能缺失等位基因中冗余或代償性反應是否掩蓋了對葉綠體生物發(fā)生的影響，作者構建了它們與Mpglk的雙突變體，發(fā)現其葉綠素含量和表型與Mpglk單突變體無顯著差異，且過表達MpGATA4無法挽救Mpglk突變體表型，表明這些基因不存在功能冗余或代償效應。

圖3. MpGATA4、MpGATA2、MpSCL和MpHY5與MpGLK在地錢的葉綠體生物發(fā)生中沒有表型作用

接著，為驗證MpGATA4、MpGATA2、MpSCL和MpGLK是否能激活葉綠體生物合成，作者構建了由強組成型MpUBE2啟動子驅動的過表達株系，以EGFP標記質膜便于分析。結果顯示，MpGATA4、MpGATA2、MpSCL過表達對葉綠素含量和葉綠體大小無影響，MpGATA2過表達在黑暗中也無生長差異；而MpGLK過表達株系呈深綠色、生長遲緩，葉綠素含量最高達對照組4倍，且其不同版本過表達均影響葉綠素含量及葉綠體大小，還能增大非光合細胞的葉綠體。以上結果表明MpGLK可激活葉綠體生物發(fā)生。

圖4. MpGLK過表達增加葉綠素含量和葉綠體大小

進一步對相關敲除突變體進行RNA-seq分析，結果顯示MpSCL、MpGATA4、MpHY5敲除分別導致243、332、160個基因下調；MpGLK敲除使1065個基因轉錄豐度降低，與MpGATA4突變體重疊85個基因。三者均影響氧化應激等過程，而MpGLK敲除還影響光合作用和葉綠素合成，對光合基因影響顯著，其他基因對光合基因表達控制有限，不足以影響葉綠體發(fā)生。

圖5. MpGLK調控光合作用相關基因的表達

為確定MpGLK的直接靶點，作者通過ChIP-seq分析，發(fā)現了2654個可重復結合峰，其結合RGATTYY基序，與開花植物GLK相似，關聯到1326個靶基因。結合ATAC-seq和H3K4me3ChIP-seq分析發(fā)現MpGLK結合開放染色質模式與擬南芥一致，40.4%的靶基因在Mpglk突變體中下調，35%在過表達株系中上調，且差異表達基因的結合強度更高，MpGLK靶基因差異表達比例高于開花植物。與五種開花植物對比，僅53個GLK靶基因保守（多參與光合作用），多數不保守。以上結果表明，GLK功能保守但調控網絡已顯著分化。跨物種互補實驗進一步證實了GLK在陸生植物葉綠體生物合成中仍起重要作用，但其作用的轉錄網絡在苔蘚與被子植物分化后的4-5億年間已顯著分化。

圖6. MpGLK的ChIP-seq揭示了地錢與開花植物之間GLK結合的差異