2025年11月11日，天津大學(xué)王方忠教授團(tuán)隊(duì)在Chemical Engineering Journal（IF: 13.2）在線發(fā)表了題為Accelerated fatty acid biosynthesis by an RCC1-domain protein enables record-high productivity in Schizochytrium的研究論文，該研究借助DAP-seq技術(shù)闡明了RCC1結(jié)構(gòu)域蛋白Srcc1在裂殖壺菌中調(diào)控脂肪酸生物合成的機(jī)制及其在高密度發(fā)酵中的應(yīng)用，將微生物油脂生產(chǎn)推向了新的高度。藍(lán)景科信為該研究提供了DAP-seq技術(shù)支持。
化石燃料枯竭及環(huán)境問(wèn)題推動(dòng)了可再生能源與高價(jià)值脂肪酸（如生物柴油原料、ω-3多不飽和脂肪酸）的可持續(xù)生產(chǎn)需求。微生物細(xì)胞工廠因避免與糧食作物爭(zhēng)地、環(huán)境友好等優(yōu)勢(shì)成為脂肪酸合成的理想選擇，但普遍存在產(chǎn)量和生產(chǎn)力低的問(wèn)題，限制了其商業(yè)化競(jìng)爭(zhēng)力。裂殖壺菌（Schizochytrium sp.）作為海洋異養(yǎng)微藻，具有生長(zhǎng)快速、生物量積累能力強(qiáng)、脂質(zhì)含量高的特點(diǎn)，是潛力的生產(chǎn)宿主，但有限的遺傳工具制約了其代謝網(wǎng)絡(luò)重編程效率，需挖掘新型調(diào)控機(jī)制提升脂肪酸合成效率。Regulator of Chromosome Condensation 1（RCC1）蛋白作為核蛋白，已被證實(shí)可提升纖維素酶和乙醇的生產(chǎn)效率，但在脂肪酸生物合成中的作用尚未被探索。
主要研究結(jié)果
核心發(fā)現(xiàn)一：構(gòu)建高密度發(fā)酵平臺(tái)，精準(zhǔn)鑒定脂肪酸合成關(guān)聯(lián)蛋白 Srcc1
1、新型調(diào)控因子Srcc1的鑒定
本研究以裂殖壺菌ZW0菌株為研究對(duì)象，建立高密度發(fā)酵工藝，并同時(shí)結(jié)合時(shí)間序列轉(zhuǎn)錄組分析，追蹤脂肪酸合成關(guān)鍵時(shí)期的基因表達(dá)動(dòng)態(tài)。結(jié)果顯示有一個(gè)基因呈現(xiàn)出與脂肪酸積累顯著的共表達(dá)模式：在脂質(zhì)快速合成階段，該基因表達(dá)量持續(xù)上調(diào)。通過(guò)BLASTp分析發(fā)現(xiàn)，該基因編碼一種含保守RCC1結(jié)構(gòu)域的未表征蛋白（Srcc1）。序列比對(duì)結(jié)果證實(shí)，Srcc1在破囊壺菌科內(nèi)具有保守性，同時(shí)在解脂耶氏酵母等其他產(chǎn)油酵母中也存在親緣關(guān)系較遠(yuǎn)的同源蛋白。鑒于該基因的表達(dá)與脂質(zhì)積累表型的緊密共表達(dá)特性，以及其在不同產(chǎn)油微生物中的系統(tǒng)發(fā)育保守性，提示其可能參與脂肪酸合成調(diào)控。
圖1 在5升生物反應(yīng)器中對(duì)ZW0菌株進(jìn)行發(fā)酵及保守的RCC1蛋白鑒定
2、Srcc1功能驗(yàn)證
過(guò)表達(dá)Srcc1后，裂殖壺菌的脂肪酸合成速率提升1.35-1.41倍，總脂肪酸含量增加1.30-1.33倍，細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)滴面積擴(kuò)大3.36-3.93倍，細(xì)胞體積增大1.79-2.59倍。進(jìn)一步在不同碳氮比（3:1和5:1）條件下驗(yàn)證，證實(shí)Srcc1對(duì)脂肪酸合成的促進(jìn)作用具有穩(wěn)定性，且不依賴特定C/N環(huán)境。隨后，作者檢測(cè)了C40（碳氮比=2:1）和C100（碳氮比=5:1）培養(yǎng)條件下三羧酸循環(huán)（TCA 循環(huán)）關(guān)鍵酶的活性及相關(guān)代謝物水平，發(fā)現(xiàn)該增效不影響三羧酸循環(huán)功能，僅增強(qiáng)檸檬酸向乙酰輔酶 A的碳通量。
圖2 親本菌株與RCC1轉(zhuǎn)化子的發(fā)酵性能比較
核心發(fā)現(xiàn)二：三靶基因協(xié)同作用介導(dǎo)Srcc1的脂肪酸調(diào)控效應(yīng)
1、解析Srcc1核定位特性
為探究Srcc1是否在轉(zhuǎn)錄水平影響脂肪酸合成，構(gòu)建Srcc1-GFP融合表達(dá)載體并轉(zhuǎn)化裂殖壺菌，結(jié)合DAPI核染色與共聚焦顯微鏡證實(shí)，該蛋白特異性定位于細(xì)胞核，這支持其作為轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子的潛在功能。
2、鎖定三大核心靶基因
為鑒定Srcc1的直接轉(zhuǎn)錄靶基因，作者開(kāi)展了DNA親和純化測(cè)序（DAP-seq），并篩選出在兩次重復(fù)實(shí)驗(yàn)中啟動(dòng)子區(qū)域結(jié)合峰均顯著富集的基因。然后進(jìn)一步挑選出脂肪酸降解、脂肪酸生物合成、NADPH生成及氧化還原酶活性相關(guān)通路的靶基因。通過(guò)Srcc1過(guò)表達(dá)菌株中候選基因的轉(zhuǎn)錄本水平，scaffold1256.g2、scaffold228.g6、scaffold287.g3、scaffold4.g24、scaffold51.g17及scaffold1693.g1被鑒定為Srcc1的潛在直接靶點(diǎn)。
進(jìn)一步EMSA結(jié)果證實(shí)，Srcc1能與所有候選基因的啟動(dòng)子區(qū)域發(fā)生特異性結(jié)合。ChIP-qPCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果可見(jiàn)，在scaffold4.g24（編碼丙二酰輔酶 A：ACP 轉(zhuǎn)酰酶）、scaffold287.g3（編碼酰基輔酶 A合成酶）和scaffold1693.g1（編碼NAD激酶）的啟動(dòng)子區(qū)域檢測(cè)到Srcc1的顯著富集，而在scaffold51.g17、scaffold228.g6和scaffold1256.g2的啟動(dòng)子區(qū)域未檢測(cè)到顯著富集。這些結(jié)果表明，Srcc1可直接激活丙二酰輔酶 A：ACP轉(zhuǎn)酰酶、酰基輔酶 A合成酶以及NAD激酶的轉(zhuǎn)錄，從而促進(jìn)裂殖壺菌ZW0菌株中的脂肪酸生物合成。
圖3 RCC1對(duì)脂肪酸合成的直接調(diào)控機(jī)制
3、解析Srcc1介導(dǎo)的脂肪酸生物合成調(diào)控網(wǎng)絡(luò)
為評(píng)估每個(gè)Srcc1靶向基因?qū)χ舅岱e累的獨(dú)立作用，作者分別構(gòu)建三個(gè)靶基因的單獨(dú)過(guò)表達(dá)載體及三基因共表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化裂殖壺菌后進(jìn)行發(fā)酵表型分析（DCW、TFA 含量、積累速率測(cè)定），發(fā)現(xiàn)單獨(dú)過(guò)表達(dá)單個(gè)靶基因僅能部分重現(xiàn)Srcc1過(guò)表達(dá)的脂肪酸增強(qiáng)表型，而三基因共表達(dá)菌株可恢復(fù)Srcc1介導(dǎo)的脂肪酸合成速率和含量提升效應(yīng)的90%以上，證實(shí)這三個(gè)基因是Srcc1調(diào)控脂肪酸生物合成的核心功能靶標(biāo)，其協(xié)同作用構(gòu)成Srcc1調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的關(guān)鍵通路。
圖4 親本菌株與單基因過(guò)表達(dá)菌株的發(fā)酵特性
圖5 親本菌株與三基因過(guò)表達(dá)菌株的表型比較
核心發(fā)現(xiàn)三：Srcc1工程菌株發(fā)酵性能突破已知微生物平臺(tái)
在5-L生物反應(yīng)器中，Srcc1過(guò)表達(dá)菌株的總脂肪酸含量、效價(jià)、得率和生產(chǎn)強(qiáng)度較原始菌株分別提升1.20倍、1.27倍、1.27倍和1.42倍，發(fā)酵周期縮短8小時(shí)。最終脂肪酸甲酯（FAME）效價(jià)達(dá)107.28±4.94 g/L，生產(chǎn)強(qiáng)度為1.58±0.07 g/L/h，超越目前已報(bào)道的微生物產(chǎn)脂系統(tǒng)（包括裂殖壺菌、解脂耶氏酵母等底盤）。
圖6 裂殖壺菌RCC1-1菌株在5升生物反應(yīng)器中的發(fā)酵曲線
小結(jié)
本研究揭示了RCC1結(jié)構(gòu)域蛋白Srcc1作為轉(zhuǎn)錄激活因子，通過(guò)直接調(diào)控三個(gè)關(guān)鍵酶基因協(xié)同促進(jìn)裂殖壺菌脂肪酸合成的機(jī)制。構(gòu)建的高產(chǎn)工程菌株具有發(fā)酵周期短、產(chǎn)率高、成本低的優(yōu)勢(shì)，為生物柴油、營(yíng)養(yǎng)脂質(zhì)（如DHA）等產(chǎn)品的工業(yè)化生產(chǎn)提供了優(yōu)質(zhì)底盤和技術(shù)支撐。為產(chǎn)油微生物的多靶點(diǎn)轉(zhuǎn)錄工程提供了新范式，對(duì)推動(dòng)生物基化學(xué)品的可持續(xù)生產(chǎn)具有重要意義。
圖7 Srcc1調(diào)控脂肪酸合成的機(jī)制解析模式圖
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